RNAi实验技术 

RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架，但长久以来，RNA分子一直被认为是小角色。然而，一系列发现表明——这些小分子RNA事实上操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。RNA干涉（RNAi）是在线虫中发现的，在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。 此后，科学家们还明白，RNAi还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。

一、什么是siRNA和RNAi？ 双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了，双链RNA对基因表达的阻断作用就被称为RNA干预（RNA interference, RNAi ）。

二、RNAi的作用机制是什么？ 目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染、转座子的转录产物、外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除、转座子的表达被阻断、外源导入基因表达被阻断，同时与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。

A、在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。

B、在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子 RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.