siRNA介导哺乳动物基因沉默

1 导言

在人类基因组（30亿bp）中，约有3－4万个编码蛋白的基因，但一半以上基因的功能仍不清楚。一项全新的技术—siRNA（small interfering RNAs）技术—已用来系统研究数以千计的基因功能及相互关系。SiRNA是RNAi的介导者之一，它通过dsRNA使同源基因沉默。用siRNA去沉默脊椎动物基因，尽管一年前才见报道，但对绝大多数脊椎动物基因功能的分析仍显示出了强大生命力。

2 RNAi的发现

2.1基因功能的分析策略

经典的正向遗传学是依赖突变体而分析基因的功能，但随着基因组测序的巨大进展，仍有数以千计的基因功能不为人们所知。反向遗传学是当今研究基因功能的最有效手段，但目前还没有一项通用的反向遗传学技术，人们只是通过对目的基因进行同源重组来分析其功能，实验周期长而且花费巨大。而最新的RNAi 技术可使目的基因沉默，是反向遗传学的一次伟大变革。

2.2 RNAi的发现

1998年，当时线虫基因组测序工作业已完成，Andrew Fire和Craig Mello提出了一项新技术：通过dsRNA诱导特异基因的沉默，即所谓RNAi。这一发明与先前的dsRNA介导植物体内的PTGS相似。Fire和Mello等指出，在线虫体内，哪怕存在几个分子的dsRNA，也足以使与其同源的基因的表达完全受阻。这一研究掀起了以RNAi介导线虫基因沉默的热潮，不仅如此，该技术在哺乳动物中的应用正如火如荼。人们不仅用RNAi来研究基因的功能，甚至还用它来治疗一些病毒引起的疾病。

3 SiRNA简介

3.1 siRNA的发现

在1999年，Andrew Hamilton 和David Baulcombe发现，在拟南芥的转基因株和病毒诱导的PTGS中，存在21－25nt RNAs，该RNAs与沉默基因序列互补，其来源是较长的dsRNA前体。还有研究表明，21－23nt的dsRNA，携带2nt 3′突出末端。这些小RNA决定了RNAi的特异性。在果蝇的基因沉默细胞中，提取到的小分子RNA，足以使原初胚胎胞容物及S2细胞的基因表达沉默。这些小分子RNA即称siRNA。

3.2人工合成的 siRNA

人工合成的21nt和22nt dsRNA也可高效诱导胞溶物中特异的mRNA的降解。人们一直努力去合成一些具有活性的siRNA。由于化学合成法造价昂贵，有人利用T7噬菌体聚合酶在体外合成siRNA：一种方法是用该酶分别转录siRNA的正义链和反义链，之后再退火以形成siRNA；另一种方法是用T7 聚合酶直接转录顺式连接的siRNA的两条链，以形成发夹结构。值得注意的是，T7 聚合酶体外合成的siRNA都具有5′三磷酸末端结构，而在果蝇中，siRNA活性必需的结构是5′一磷酸末端。因而，在哺乳动物中，要么其5′三磷酸 需转化成5′一磷酸，要么其5′端的结构要求并不严格。还有人利用纯化的细菌RNaseⅢ，在体外加工较长的dsRNA以产生siRNA。

4 stRNA简介

4.1 stRNA的发现

研究生物体内基因表达调控的一个新策略始自线虫中lin-4和 let-7 RNA的发现。这两种RNA均来自于70nt具发夹结构的前体RNA，经加工形成22nt 的RNA。在线虫和蠕虫中，lin-4和 let-7的基因均与发育的时序性有关，一旦突变，都会引起异时序性的发育缺陷。如蠕虫的lin-4突变体停留在幼虫期而不再向前发育，而let-7突变体则滞留于幼虫的最后一