专用转染试剂

5 siRNA专用转染试剂

5.1. 如何将siRNAs递送至哺乳动物细胞中？

将siRNA完整高效地传递到特定细胞内，是RNAi实验的第二个关键要素。转染效率低和细胞活性低往往是基因沉默实验失败的常见原因。虽然siRNA比质粒DNA更容易转，不过依然需要优化转染条件，否则，一个有效的siRNA就可能因为转染效率不高而得不到理想的结果。一旦一种细胞株建立了标准方法，以后就容易得到可重复的结果。

由于没有抗生素筛选压力，siRNA转染本身很难保证100%的细胞被成功转染----实际上除了荧光标记的siRNA参照，并无法区分已经转染的细胞和未转染的细胞。而混迹其中的未转染细胞内由于没有发生RNAi反应，因而目标基因的表达不会下调，在后继的RNA纯化和荧光定量检测中就很可能会干扰结果----生物通编者为此特地请教过Qiagen新加坡的技术专家，他们也认为除去以荧光标记对照评估转染效率，目前也没有很好的方法。用18s来平衡检测结果可以减少因细胞数目变化而对结果产生的影响，却也不能区别出未转染细胞。siRNA和带报告基因的质粒共转染虽然可行，但是过多的外源干涉可能会增加结果分析的复杂性。因此通过实验优化条件找到转染效率高的转染试剂，建立对某种细胞株的标准转染方法，对RNAi实验来说格外重要。

目前较常用的siRNA转染方法有2种：脂质体类转染试剂和电转染。随RNAi热遍全球，各厂家纷纷推出了各种siRNA转染试剂，绝大多数的贴壁细胞都可以用适当的转染试剂转染，生物通小编随后会逐一介绍比较。并非所有细胞都可以用脂质体转染试剂成功转

染的。对于部分特别难转染的细胞株，悬浮细胞，原代细胞来说，当转染试剂不管用时，电转染是行之有效的另一个选择。我们前面提及RNAi实验不需要特殊的仪器，但是如果有适当的仪器，比如电转移仪，实验会更方便。我们平时使用的DNA转染试剂是否可用于siRNA转染？不是不可以，只是效果不是最佳，所以还是建议选择专用的siRNA转染试剂。

脂质体转染也可分为2种方法，一种是常规的转染方法：细胞铺板后等第二天长到50％－80％之间（不同的转染试剂有不同要求，生物通小编个人经验是转染试剂细胞毒性高的要求长满一些，细胞多一些，就算死伤惨重也还能留下多些活口，嘿嘿，对于质粒转染来说这并非评判转染试剂好坏的标准，毕竟只要转进去就算OK了，但是对于RNAi实验来说就不同了），将siRNA和转染试剂混合物加入共同温育一段时间，更换培养基，再培养24－48小时检测mRNA含量等等。

创新的方法是反向转染。这种方法称为reverse transfection或者neofection，和传统转染方法相比区别在于，传统方法需要提前一天接种铺板，培养24小时后等细胞到一定汇合度再加转染复合物转染；而反向转染则是不用预先接种细胞，先加入转染试剂和siRNA混合物在培养板上共同温育，然后再加入细胞铺板，培养。这个方法的好处不单是可以节约一整天的时间，而且转染效率高。原因可能是由于细胞尚未贴壁时接触转染试剂siRNA复合物的表面积更大，使得转染效率更高。大量的细胞株实验表明，其他条件相同的情况下，反向转染得到的RNA干扰效果比传统转染方法更好，连一些难以转染的细胞株如HepG2细胞也能得到非常好的RNAi结果。在反向转染实验中，细胞的密度不再困扰实验人员，有