转化培养方法总汇

1.草地贪夜蛾( S podoptera f rugierda) Sf21 细胞系, E. coliDH5α,AcMNPV 1A 株,质粒pHZ402 ,pAcDZ1 均为本实验室保存,转座子构建质粒pMod2 购自Epicent re. Sf21 细胞用TNM2FH 培养液加10 %胎牛血清培养. 细菌、质粒、基因操作参照文献7 .

Sf21 细胞悬浮培养至约1 ×106 个时(参照文献8 ) ,按MOI = 1 pfu/ cell 接种AcMNPV ,48 h 后,细胞悬液以5 000 r/ min 离心15 min ,取上清液. 上清液再以17 000 r/ min 4 ℃离心30 min ,用450μL 无菌水悬浮沉淀. 加入50μL 10 %的SDS ,56 ℃30 min ;加入蛋白酶K至100μg/ mL , 再次56 ℃30 min. 用酚/ 氯仿法抽提病毒基因组DNA ,乙醇沉淀DNA. 以50μL 无菌水溶解DNA ,4 ℃放置待用

细胞转染

5 ×105 个Sf21 细胞27 ℃静置培养2 h ,使细胞贴壁. 取5μL 上述转座反应液,用Cellfectin ( Invit ro2gen) 转染细胞,方法参见产品说明书. 转染后细胞27 ℃培养,Nikon HFX倒置荧光显微镜观察. 转染后72h ,收集细胞的培养上清液,作为重组病毒库的原代病毒液,4 ℃保存备用.

2.参照Summers 的方法,重组转移载体pBacPAK2CE2 DNA 2μg 与线性化的病毒Bm2BacPAK6 DNA 500ng在脂质体的介导下共转染BmN 细胞(具体操作按Dosper 脂质体产品说明书进行) 。约4～7 d 细胞出现病毒感染症状,收集病毒液进行空斑筛选,挑斑于铺有单层BmN 细胞的96 孔板中,27 ℃条件下培养3～4 d ,用X2gal 挑选出白斑,再进行3 轮筛选以纯化重组病毒。

3.杆状病毒转移载体质粒PACSecG2T、sf9 细胞购自GIBCO BRL 公司,TNM2FH 昆虫细胞培养基、无血清昆虫细胞培养基、核多角体野病毒(ACNPV) DNA、磷酸钙共转染试剂合购自BD pharmingen 公司, 重组病毒的构建[2～4 ] 含有插入片段的重组质粒经纯化后与线性化的Baculo GOLDTM DNA ,采用磷酸钙介导的细胞转染法,经有限稀释法和空斑实验筛选重组病毒,具体操作见BD Pharmingen 公司手册,

表达产物的获得 将感染复数MOI 为7～10 的病毒加入处于对数生长期的sf9 细胞中,室温吸附2 h 后,用无血清培养基清洗2 次,再加入3 mL 新鲜的无血清培养基,28 ℃培养72～9 6 h ,收集细胞培养上清液。 重组蛋白的表达和特异性 以含病毒的上清液接种对数生长期的sf9 细胞,2 8 ℃培养3 d ,收获细胞,超声破碎,离心收集上清液电泳观察结果

4.选用美国Pharmigen 公司的磷酸钙共转染法将重组质粒导入Sf9 细胞,27 ℃培养5 d后,收获上清。将转染上清经噬斑纯化和扩增制备表达毒种,用Sf9 细胞或H5 细胞进行大量表达,MOI(感染指数,即每个细胞感染病毒的数量) 在3～10左右,27 ℃培养3～5 d 后,收获表达上清。

5.杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A , 线性化亲本AcMNPV 病毒Bac2N2blue DNA 为Invit rogen 公司产品。草地夜贪蛾Sf9 细胞由本室（中国科学院武汉病毒研究所）保存。同Insectin2plus Liposomes 脂质体及线性化亲本病毒Bac2N2blue DNA 共转染Sf9 细胞, 27 ℃培养5d。观察到典型的细胞病变特征后,收集细胞培养物上清液。将转染后上清液经系列稀释,感染贴壁良好的Sf9 细胞单层,然后以浓度为1. 25 %的低温琼脂糖Baculovirus Agarose 覆盖(含150μg/ mL X2gal) ,27 ℃培养7d 后挑取蓝色空斑。重组病毒感染Sf9 细胞,27 ℃培养96h 。将培养液于5 000g 离心5min ,PBS 洗涤沉淀3 次,细胞沉淀经细胞裂解液裂解(50mmol/ L Tris2HCl ,5 % 22巯基乙醇,0. 4 % SDS ,10mmol/ L EDTA) ,同时培养液上清经10 倍浓缩,分别上样进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot 分析检测CagA 的表达。

6.杆状病毒转移载体 pVL 1393, 本室（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室）保存。限制性内切酶及其修饰酶 购自P rom ega 和Cibco 公司。