392陕西医学杂志2007年4月第36卷第4期

大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良

中国医科大学附属第一医院内分泌科(沈阳110001)　吴志香*　王玉霞△　刘国良　　摘　要　目的:探讨一种简单易行的大鼠胰岛细胞培养方法,获取尽可能多的高质量胰岛,并寻找进行体外实验研究的最佳时间和条件。方法:运用胶原酶 原位灌注法分离胰腺,Ficoll400纯化胰岛细胞,双硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛,,放免法检测胰岛素分泌考察胰岛功能。结果:胰腺,细胞存活率为92.3±2.3%,GSISSI.±0.可获得数量多,。分离和提纯　大鼠

Animtmofprimarycultureofwistarratpancreaticislets

DepartmentofEndocrinology,theFirstAffiliatedHospital,ChinaMedicalUniversity

(Shenyang　110001)WuZhixiang　WangYuxia　LiuGuoliang

　　ABSTRACT　Objective:Tostudytheeffectsofisolatingandculturingtheratpancreaticisletsin

vitro.Methods:Afterintraductalinfusionof8210mlcoldHank’sbalancedsolutioncontaining1mg mloftype collagenase,pancreasweresurgicallyprocuredanddigestedat37℃for15220min,andstoppeddigestionbycoldHank’ssolutionwhentheemulsionappeared.TheisletswerepurifiedbydiscontinousFicolldensitygradient(25%,23%,20.5%and11%)centrifugation,andthedegreeofpuritywasdefinedasdithizonestaining.Animationofisletswasobservedandinsulinsecretionwasdetected.Results:438±27isletswereprocuredfromonerat,andsurvivalratewas92.3±2.3%,Glucosestimulatedinsulinsecretioninvitroshowedthemeanvalueofinsulininthelow2glucosemediumwas39.74±2.73mM,whilethatofhigh2glucosemediumwas128.94±8.72mM,theSIwas3.25±0.26.Conclusion:Thismethodcouldobtainlargequantitiesandhighqualityislets,whichofferedbetterexperimentalconditionsforcellstudy.

physiology　Istetsoflangerhams isolationKEYWORDS　Cellculture　Istetsoflangerhams purification　Rats

　　近年来许多有关糖尿病方面的研究均利用体

外培养的胰岛细胞株作为研究对象,然而源自肿

瘤细胞系的细胞株毕竟在基因表达功能上与正常细胞有差别,因此,本研究采用了培养的大鼠原代胰岛细胞作为研究对象,以期更接近在体研究的结果,同时又可避免在体研究很难避免的混杂因素。

材料与方法

1　实验材料　实验动物选择两月龄的健康Wistar大鼠,体重250±23g,购自中国医科大学实验动物中心。主要试剂有 型胶原酶(collagenasetype ,Sigma);RPMI1640及

*辽宁中医药大学附属第一医院

DMEM培养基(GIBCO)、胎牛血清(FBS

,

青霉素、链霉素(华北制药厂)、Hyclone)、Ficoll400(Pharmacia)、Hank’s液,40目不锈钢网,

(OA,北京华美)。HEPES(Sigma)、DTZ(Sigma)、

胰岛素放免药盒(北京原子高科技核技术应用股

份有限公司灵敏度:1.5mIU L;精密度:批内Cvv5%,批间Cvb10%)

2　实验方法

2.1胰岛细胞的分离纯化:胰腺的原位灌

注:Wistar大鼠禁食16h后,10%水合氯醛腹腔麻醉,常规消毒后经腹中线开腹。暴露胆管,寻找胆管穿过胰腺进入十二指肠处,320丝线穿过(暂不结扎),充分暴露胰尾,在肝门胆管分叉处逆行胆管插管,少量推入含冷却的胶原酶(1mg ml)

△中国医科大学附属第四医院