15种蛋白质单晶培养的方法

15种蛋白质单晶培养的方法：

（1）大量养晶法（bulk crystallization）：若急着养出单晶，则将纯化之蛋白质溶液加入固体盐类或饱和盐液，直到溶液中出现乳白混浊色，离心后把上清液（suppernatant）放置数天至数周，有可能养出单晶。

（2）批次养晶法（batch method）:若发现加入蛋白质的沉淀剂和盐类等化学药品，在浓度C1产生沉淀，浓度Cn为液体，则在C1至Cn之间细分成一串浓度C1>C2>C3>….>Ci>Cn，（n-2）个小试管进行养晶，可能结出单晶。此法之主要缺点在于蛋白质的消耗量大。

（3）大量透析法（bulk dialysis）：把蛋白质溶液包在半透膜（membrane）内，浸入盛有化学药品的器皿中，半透膜能让小分子进出，却不会让蛋白质等大分子通过，则器皿中沉淀剂、盐类和有机溶液等化学药品会穿过半透膜，与蛋白质起作用，直到膜之内外的浓度梯度（concentration gradient）降到零为止。此法的好处在于，器皿中化学药品之浓度可作连续之调整，pH值的范围也可探讨。坏处是膜之内外浓度差异减少时，平衡速率也随之降低。

（4）微量透析法（microdialysis）:把半透膜的体积缩小，绑在比钮扣略大的衬架上，架体之凹槽内注入蛋白质溶液，包覆半透膜的体架放入盛有化学药品的器皿，其养晶原理与大量透析法相同，只是使用蛋白质和化学药品的量放得少。注意凹槽内不得留有气泡，否则膜外的化学药品为气泡所阻止而无法透过气泡，渗入膜内的蛋白质溶液。

（5）连续萃取（sequential extraction）：此法所根据的原理是亚可比（Jacoby）的实验，他发现蛋白质在硫酸铵溶液中溶解度随温度的提升而下降。在4℃以下取得上清液（supernatant），放在室温长晶。先将蛋白质溶液加入固体硫酸铵或饱和硫酸铵液体，使蛋白质溶液沉淀，离心除去上清液。接着保持4℃以下处理一系列的蛋白质沉淀物。准备数种依次递降浓度的沉淀剂（通常为蒸馏水），浓度高的沉淀剂先加入上述蛋白质沉淀物中，以玻棒搅拌并离心，取出上清液，放在室温养晶，再把浓度次高的沉淀剂加入上次未完全溶解的蛋白质沉淀物，搅拌离心，把上清液置于室温养晶，依次类推，直到蛋白质全部溶解为止。这样每次取出的蛋白质浓度依次递减，溶液由低温移至高温，符合亚可比的准则，可能养出蛋白质单晶。

（6）自由接口间的扩散法（free interface diffusion）：若蛋白质在不同的溶剂中具有不同的溶解度，则蛋白质注入盛有沉淀剂试管的上方或下方（依密度而定，密度大者放在下方），在两种溶液的交界面扩散会有晶核长出，装置如图7-10所示。

（7）凹盘或玻片上的蒸汽扩散法（vapor diffusion on plates or slides）—座滴法：蛋白质养晶的要领在于蛋白质达成过饱和溶液，同时添加的化学药物与蛋白质起作用，协助晶核的形成。掺有化学药品的蛋白质溶液，其水分慢慢扩散，达到过饱和溶液则有可能长出单晶。若蛋白质溶液暴露在空气中，水分蒸发掉，则蛋白质干涸，无法形成单晶，原因是蛋白质单晶约略维持液态的结构，含有大量水分，水分与蛋白质间形成许多氢键，水分蒸发，蛋白质也无以为系，因此必须保持水分，使蛋白质溶液密闭在一个容器中。同时还得调节水分，所以必须置放两种溶液，使蛋白质溶液中的水分扩散到另一种高浓度的溶液中，以达蛋白质溶液的过饱和。通常选择适当的盐类和有机溶剂，调在等电点的pH值，形成沉淀剂，把粉晶蛋白质泡成一定浓度，约在5～40mg/ml之间，在凹盘的下凹孔镀硅，注入一些蛋白质溶液和沉淀剂总共10～40 m l。在凹盘外方的塑料盒，倒