本资料为本研究室实际研究情况并结合文献网络资料总结所得,希望能给同行们带来帮助!欢迎交流!

电转法

设计方案一：

感受态制备：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；

2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm

培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3. 于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；

4. 加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇

匀，于30度轻轻摇动45min；

5. 再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；

6. 于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；

7. 2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；

8. 每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。 电转化：

1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，

转移至预冷的电转杯中，静置5min；

2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；

3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；

4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h；

5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。

设计方案二：

感受态制备：

1. 挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；

2. 取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm

培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3. 于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬

于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc， 10 mM DTT， 0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min；

4. 4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三

次，离心条件一样；

5. 每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山

梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。

电转化：

1. 向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移

至预冷的电转杯中，静置5min；

2. 擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆；

3. 立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；