大鼠原代肝细胞培养方法的建立

倪慧王玲玲

韩涛刘学忠*

渊扬州大学兽医学院袁江苏扬州225009冤

摘要体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多袁但均存在一些缺陷遥对胶原酶灌流法进行改良袁采用细胞密度为6伊105个/mL袁细胞生长状态好袁既能保证细胞活率袁又能满足下一步试验要求遥用胰酶代替胶原酶进行肝脏灌注袁胰酶最适浓度为0.18%袁且灌流时维持最适温度37益袁分离得到的肝细胞存活率大于90%袁且纯度很高袁是一种操作简便尧细胞存活率和纯度较高的新的大鼠原代肝细胞体外培养方法遥

关键词细胞培养曰原代曰大鼠中图分类号Q813.1+1文献标识码A文章编号1007-5739渊2013冤12-0226-02

接剪切法[5]尧组织块消化法[6]和两步胶原酶灌流法[7-8]等遥由于肝细胞体外培养增殖能力差袁原代培养的细胞存活率不高袁故在一定程度上阻碍了肝细胞体外模型的广泛应用[9]遥直接剪切法和组织块消化法所分离肝细胞杂质较多袁细胞纯度不高袁酶消化反应不易控制袁且过多的结缔组织直接影响细胞的正常生长等袁不利于细胞生物学和分子生物学的进一步研究遥胶原酶灌流法分离的肝细胞数量多且活力好袁是分离大鼠原代肝细胞的经典方法[3]袁但由于操作方法较为复杂袁限制了该方法的广泛应用遥该试验对胶原酶灌流法进行

体外培养大鼠原代肝细胞的方法很多[1-4]袁常用的有直

浸润的纱布袁并在灌流过程中用37益的PBS不断浸润袁保曰在肝门静脉的近心端和远心袁缓慢抽出针芯袁若回血袁袁将输液器连接留置针袁D-Hanks液以流速为25mL/min袁待肝脏变

为土黄色后袁尧D-Hanks液以流速为曰取下kU/L青霉素和100kU/L链霉的次袁1豫BSA-Hanks液中终袁去除肝包膜及血管等袁袁分别用100尧200目的筛网过滤袁500r/min离心5min袁去上清袁沉淀中加600r/min袁5min袁去除上清液袁用1豫BSA-

了改良袁试图建立一种操作简便尧新的大鼠原代肝细胞体外培养方法遥1材料与方法1.1试验材料1.1.11.1.2

试验动物遥健康雄性SD大鼠袁g试剂及仪器遥Williams爷MediumE渊mL/L胎牛血清尧100kIU/L青霉素和100mg/L链霉完全培养基重悬袁500r/min离心5min袁用WME遥

苏大学实验动物中心提供遥

链霉素渊Penicillin/streptomycin冤院酰胺渊L-glutamine冤袁噻唑兰渊清白蛋白渊bovineserumAmresco袁胎牛血清渊fetalbovine冤院USA曰为国产分析纯遥

院Germany曰超纯Sartorius袁Germany曰AE21院Leica袁Germany曰水制备装置PS-9000705院USA曰BS210S院

1.2.2肝细胞的产量及活率的测定遥在显微镜下使用血细

胞计数板袁通过细胞计数的方法得出细胞产量曰台盼蓝排斥1颐9的比例混合袁在显微镜下统计未染色细胞占细胞总数的百分比袁计算细胞活率遥

法检测细胞活力并计数袁使用0.4豫台盼蓝与肝细胞悬液以

1.2.3肝细胞体外培养遥试验前先用鼠尾胶原包被培养板备用袁用含10%FBS的WME培养液调整细胞密度为6伊105个/mL袁六孔培养板接种2mL/孔袁96孔培养板接种100滋L/孔袁置37益尧5%CO2培养箱培养4h贴壁后袁用滴管轻轻吹打换液袁以除去死细胞及未贴壁的细胞袁每隔12h换液遥1.2.4

离纯化和接种的肝细胞进行形态学观察并拍照遥2结果与分析

2.1肝细胞体外培养的形态学观察

倒置显微镜下观察分离的肝细胞形态袁可见肝细胞形态完整尧分布均匀袁饱满袁透光度好袁呈光亮圆形袁胞核清晰渊图1冤曰接种培养4h换液袁大部分细胞已贴壁生长袁细胞饱满袁胞核清晰袁呈单核或多核细胞渊图2冤遥2.2肝细胞的产量及细胞活率

用刚分离的肝细胞做台盼蓝排斥试验袁结果显示活细胞的胞浆及胞核均排斥染色袁整个细胞拒染袁呈透亮无色渊图3冤袁细胞存活率大于90%遥计数得出平均每只大鼠肝脏

肝细胞形态学观察遥试验过程中用倒置显微镜对分

pH计院MettlerToledo袁Switzerland二氧化碳培养箱HF90院

水槽DK-600型院上海精宏实验设备有限公司曰漩涡振荡仪1FD院苏州净化设备有限公司遥1.2试验方法

ZW-A院江苏金坛荣华仪器有限公司曰超净工作台SW-CJ-[10]

Thermo袁USA曰电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140A袁电热恒温

1.2.1大鼠肝细胞的分离遥该试验对Seglen两步胶原酶灌注法进行方法改良袁取禁食24h的SD大鼠袁用2豫戊巴比妥钠渊40mg/kg.b.w冤腹腔注射麻醉袁并注射肝素钠抗凝曰将大鼠固定袁腹部皮肤消毒袁沿腹中线打开腹腔袁将肠拨到左侧袁暴露肝门静脉和下腔静脉袁在肝脏表面铺一块用37益PBS

基金项目江苏省大学生实践创新训练计划渊2012JSSPITP1349冤曰国家

大学生创新创业训练计划渊201211117037冤遥*通讯作者

收稿日期2013-05-09