通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因需要模板吗、为什么

通过DNA合成仪利用化学方法人工合成目的基因需要模板吗、为什么

不需要模板。

人工合成DNA序列可以说是一种从无到有的合成，例如ATCG四核苷酸序列，先将G的5‘端利用特定进行保护，3’暴露，然后加入3‘端保护的C，并进行合成反应，这样就可以合成3'CG5',然后去掉C3‘保护基团，再加入3’端受保护的T，继续缩合，这样依次进行，最后合成所需要的核苷酸序列。这与PCR的原理是不同的。

第一节 化学法合成目的基因

这种方法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。

一．磷酸二酯法

磷酸二酯法的基本原理是，将二个分别在5′-或3′-末端带有适当保护基的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸。

DNA合成所采用的出发原料是脱氧核苷酸或脱氧单核苷酸；它们都是多功能团的化合物。必须将不参加反应的基团用适当的保护基因选择性地保护起来。这样，具5′保护的单核苷酸,便能够通过它的3′-OH 同另一个具有3′保护的单核苷酸的5′-P之间定向地形成一个二酯键,从而使它们缩合成两端均被保护的二核苷酸分子(图3-1)。实验中使用的各种不同的保护基团,有些可以通过酸处理移去，有些则可以用碱处理移去。一端脱保护的二核苷酸分子，如带5′保护的二核苷酸分子，又能够同另一个带3′-保护的单核苷酸分子进行第二次缩合反应，形成一个三核甘酸分子。这样从缩合反应开始，到保护基团的消除，再进行新一轮缩合反应。如此反复进行多次，直到获得所需长度的寡聚脱氧核苷酸为止。

二．亚磷酸三酯法

原理是将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程如图3-2。

三．寡核苷酸连接法

化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。常用的基因组装方法主要有以下二种：

第一种方法是先将寡聚核苷酸激活，带上必要的5’-磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。

第二种方法是将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上（图3－3）。

限制化学法合成基因的因素主要有三：①已知序列且有应用价值的基因很少，而植物来源的基因更少；

②化学合成的寡核苷酸片段长度有限，经基因组装才能合成较大的目的基因，而这往往使基因制备难度加大；

③化学基因合成相比之下比较昂贵。