小鼠肝脏DNA提取与鉴定

发布日期：2008-07-17 来源：生技网信息中心 浏览次数：652

实验原理：

DNA 以核蛋白形式存在于细胞核中。蛋白酶K 或链霉蛋白酶 E 均为广谱蛋白酶，其重要特性是能在 SDS 和 EDTA 存在下保持很高的活性。在匀浆后提取 DNA 的反应体系中， SDS 可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分子分离， EDTA 抑制细胞中 DNase 活性，蛋白酶 K 或链霉蛋白酶 E 将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分离出来。再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染。最后用无水乙醇沉淀 DNA 。为获得高纯度 DNA ，操作过程中常加入 RNase 除去 RNA 。获得高分子量 DNA 的关键是防止 DNase 降解 DNA 。故标本必须新鲜，在提取前细胞就保持完整，核、溶酶体等细胞器应没有明显破坏，提取 DNA 用的离心管等器皿及试剂应消毒。操作在4 ℃以下进行。

试剂及器材

1 ．试剂

蛋白酶 K ：称取 20mg 蛋白酶 K 溶于 lml 消毒双蒸水中，－ 20 ℃备用。

RNase( 牛胰 ) ：称取 10mgRNase 溶于 lml 下列混合液中： 10mmol/l Tris-HCl ， pH8.0 ； lmmol/L EDTANa2 pH8.0 ； 50 %甘油。

10 %SDS 溶液：称取 10gSDS 溶于 100ml 消毒双蒸水中，于 65 ℃保温 2 小时，贮存室温备用。

1 × TE 缓冲液 (pH8.0) ： 10mmol/L Tris-HClpH8.0 ； lmmol/LEDTANa2 pH8.0 。配制后高压灭菌， 4 ℃贮存。

1 × TE 饱和重蒸酚 (pH8.0)

氯仿/异戊醇 (24:1V/V) 10mol/LNH4 AC ，配制后高压灭菌， 4 ℃贮存 无水乙醇 (AR)

70 %乙醇

2 ．器材

玻璃匀浆器；离心机；电泳仪；电泳槽；紫外透射反射分析仪。

实验操作

1 ．组织 DNA 的提取

1) 取小鼠新鲜肝组织，去除结缔组织，用剪刀剪成细小碎块

2) 加 10 倍体积 TE 缓冲液，用玻璃匀浆器在冰浴中中速匀浆

3) 将匀浆液转入 10ml 离心管以 4000rpm 离心 10 分钟，弃上清