74中药药理与临床2009;25(3)

银杏叶提取物血清药理学方法的建立及验证

魏雅芹,汤道权,高媛媛,印晓星,陈永刚,韩琳

(徐州医学院药学院,徐州　221004)

　　摘　要　目的:建立并验证银杏叶提取物(GBE)血清药理学研究方法。方法:MTT法确定体系中血清添加量;HPLC法结合药效法确定大鼠给药方案及采血时间;以T2SOD、MDA为指标测定该含药血清的抗氧化能力。结果:大鼠按人临床用药等效剂量的5倍,每日两次连续4天灌胃给予GBE,于末次给药后2h采血时血清中GBE各有效成分的含量最高;体系中加入20%该条件下制备的含药血清对大鼠肾小球系膜细胞(MC)正常增殖没有影响;采用该方法制备的GBE含药血清具有明显的抗氧化能力。结论:本实验条件下制备的GBE含药血清具有明显的抗氧化能力,该血清药理学方法能用于GBE含药血清药效及机制研究。　　关键词　银杏叶提取物;血清药理学;抗氧化;HPLC　　血清药理学作为中药复方研究中体外实验的主要方法之一仍存在不足之处[1～3],实验的各个环节,包括实验动物的选择、给药方案、采血时间以及血清添加量等,还需要不断摸索　　据文献报道,银杏叶提取物(GBE)有多种与糖尿病肾病(D)理作用[4],胞(Mesangialcells,MC),采用HPLC、MTT等方法,结合药效学实验,寻找含GBE血清的制备方法并确定体系中血清银杏叶提取物血清药理学方法的建立和验证,以期建立GBE中药血清药理学的研究方法,并以T2SOD、MDA为指标测定含药血清的抗氧化能力,对建立的方法进行验证。

μm微孔滤膜过清,灭活,0.22置.5.　MC细胞常规培养于含10%小牛血

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M培养基(含青、链霉素100U/ml)中,于37℃、5%

CO2培养箱中连续培养。

1.5.3　体系中最佳空白血清添加量的确定　制备空白血清,

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取对数生长期的MC细胞以1×10的密度按一定体积接种于

96孔板内。24h后弃去培养基,分别加入0、4、10、20、30、40、60、100、160、200μl空白血清,剩余体积用含10%小牛血清的

μl,使成含空白血清为0、DMEM培养基补齐,每孔终体积为200

2、5、10、15、20、30、50、80、100%的培养基,每组设6个平行孔。

1　材料与方法

1.1　试验药物　GBE(No.040029),徐州恩华药业股份有限

公司),取GBE粉末,加0.5%CMC2Na制成混悬液。1.2　动物　SD大鼠,SPF级,210～230g,雌雄各半,由徐州医

常规培养48h后,弃去培养基,每孔加入MTT溶液(5mg/L)20

μl,避光继续培养4h。终止培养后,每孔加入150μl二甲基亚砜,反复吹打,沉淀充分溶解15min后,于酶标仪上测定各孔

A492值。

1.5.4　最佳采血时间的确定

学院实验动物中心提供。

1.3　试剂　DMEM:Gibco公司(withD2glucoseat25mmol/L);四氮唑蓝(MTT):Sigma公司(No.M2128);新生牛血清:杭州四季青生物工程材料有限公司(No.061221);胰蛋白酶:Gibco公司(No.27250018);SOD、MDA测试盒:南京建成生物工程研究所(No.20080628)。

1.4　仪器　class100型CO2培养箱:美国Sheldon公司;270℃超低温冰箱:美国Form公司;CK4倒置显微镜:日本O2LYMPUS公司;128ce型酶标仪:澳大利亚Clinibio公司;Shimad2zuLC210A高效液相色谱仪:日本岛津制作所(包括SCL210Avp系统控制器,SPD2M20A二极管阵列检测器,DGU220A在线脱气机,LC210ADvp两元泵,7725i进样器)。1.5　方法

1.5.1　GBE含药血清的制备　大鼠32只随机分成4组,分别为空白对照组、GBE低、中、高剂量组(100、200、400mg/kg)。各给药组分别灌胃给予相应剂量的药物,空白对照组给予相应体积的CMC2Na溶液,每天上、下午各一次,连续给药4天。全部大鼠于当日末次给药后一定时间下腔静脉取血,无菌分离血

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　　GBE含药血清制备　大鼠54只,按采血时间点随机分成9组,每组6只,雌雄各半。每组大鼠均灌胃给予400mg/kg药物,每天2次(上、下午各一次),连续给药4天,各组分别于末次给药后15、30、60、90、120、150、180、210、240min下腔静脉取血,一部分血浆3000rpm离心10min,分离血清,220℃保存备用。另取一部分血浆无菌分离血清,同组血清合并后经56℃、

μm微孔滤膜过滤,置230min灭活,0.2270℃冰箱保存备用。　　血样处理方法　取大鼠血清0.5ml,加入丙酮2乙醚(1∶

14)3ml,涡旋2min后,4000rpm离心10min,分离上清液得溶液Ⅰ,残留物加入甲醇1.5ml,涡旋2min后,4000rpm离心10

min,分离上清液得溶液Ⅱ,合并溶液Ⅰ和Ⅱ,35℃水浴N2吹

干。残渣加入200μl甲醇20.1%甲酸(80:20)溶解,14000rpm离心15min,取上清液,备用。

　　色谱条件　色谱柱为kromasilC18(大连依利特有限公司,250mm×4.6mm,5μm);以甲醇为流动相A,0.1%甲酸水溶液为流动相B,按表1中的程序进行梯度洗脱;流速:1.0ml/

min;检测波长:350nm;进样量:20μl。

江苏高校自然科学基金项目资助,项目编号:07KJD360225　　　　33通讯作者