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实验三 细胞冻存与复苏技术

实验三 细胞冻存与复苏技术

谢云飞

生科院 医用生物学教研室 3831928

一、实验目的

1．掌握细胞冻存与复苏的原理。

2．熟悉体外培养细胞液氮冻存技术及冻存细胞的复苏技术。

3．掌握细胞计数的一般方法。

4. 掌握离心机的使用方法

二、实验原理

在不加任何保护剂的条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变等，引起细胞死亡。向培养液中加入保护剂可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。 目前细胞冻存多采用二甲基亚砜（DMSO）或甘油作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，能提高细胞膜对水的通透性。

复苏细胞采用快速融化的方法，使细胞迅速通过细胞最易受损的－50～0℃，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。

细胞冻存及复苏的基本原则是“慢冻快融”。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。复苏细胞时则直接将装有细胞的冻存管投入37-39℃热水中迅速解冻。

三、实验步骤

（一）冻存

1．将1 ml鸡血细胞悬液（1%）转移至离心管中，加入7 ml生理盐水。

2．1000rpm离心5 min，弃上清液。

3．向沉淀中加1 ml冻存液，重悬。

4．将悬液转入冻存管中，将冻存管口封严。

5．将冻存管装入吊桶，用两层纱布封口，悬吊于液氮罐口内的气态氮中放置20min，然后浸入液氮（-196℃）中。

（二）复苏

1.准备37℃的水浴箱。

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