第8卷第6期安全与环境学报Vol.8 No.6

2008年12月JournalofSafetyandEnvironment Dec,2008

文章编号:100926094(2008)0620018205

球(简称/磁珠0)的技术[4]。该技术生产的磁珠仅在磁场中表现出磁性,因此向样品中加入磁珠时,磁珠分散并能与样品充

分混合;当在试管一侧添加强磁场时,磁珠能迅速发生力学迁移并吸附在靠近磁场的试管内壁,移除样品后即可将磁珠分离。

免疫配基包被于磁珠外表面,主要包括一抗、二抗和蛋白质A/G。包被一抗的免疫磁珠可直接使用,方便快捷,但仅适用于特定靶物质的分离;包被二抗或蛋白质A/G的磁珠必须再包被一抗才能捕获相应靶物质,但其能与多种相应的一抗结合,灵活性强。

免疫磁珠表面的特异抗体能与样品中的靶物质(具有相免疫磁珠分离技术在环境病原微生物检测中的应用*

杨 万,何 苗

(清华大学环境科学与工程系,环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京100084)

摘 要:介绍免疫磁珠分离技术的原理和操作步骤,分析其主要影响因素。介绍该技术在环境样品病原菌、原虫及病毒检测中的应用及研究进展。环境样品成分复杂,需经适当分离纯化处理再进行病原微生物检测,从而保证检测结果的可信性。免疫磁珠分离技术兼具免疫反应的特异性及磁性分离的快速性,能够有效分离纯化环境水样中的病原微生物,广泛应用于病原微生物的检测。

关键词:环境质量监测与评价;免疫磁珠分离技术;分离纯化;影响

因素;病原菌;原虫;病毒

中图分类号:X830 文献标识码:A

0 引 言

环境中病原微生物严重威胁人类健康,必须进行有效监

测,及时预警。环境水样组分复杂,不仅含有多种非生物杂质,还含有多种非目标微生物,严重干扰目标病原微生物的检测;而且环境水样中病原微生物的含量较少,无法直接检测,通常需对水样进行浓缩处理,但浓缩后常会加剧干扰物质对检测的干扰。因此,需通过有效分离纯化技术对受检病原微生物分离纯化,以避免或减少检测结果的假阴性或假阳性。免疫磁珠分离技术(ImmunomagneticSeparation,IMS)整合了免疫反应的高度特异性和磁性分离的快速、简单优点,广泛用于细胞的分离提纯、体外扩增、HLA分型、靶向释药、微生物

检测等[1,2]

。免疫磁珠分离技术能够有效分离纯化环境水样中的病原微生物,如肠出血性大肠杆菌O157BH7等病原菌及两虫(贾第鞭毛虫、隐孢子虫),此外该技术在病毒检测中也有良好应用前景。

本文根据免疫磁珠分离技术的基本原理和操作步骤,分析其主要影响因素,并探讨该技术在病原菌、原虫及病毒检测中的应用及研究进展。

1 免疫磁珠分离技术原理

免疫磁珠分离技术借助免疫磁珠捕获样品中靶物质,通过磁珠在磁场中的运动使靶物质(如病原微生物)分离。免疫磁珠由磁性载体和免疫配基结合而成。天然磁性材料可从磁性细菌中分离获得,如解宇[3]

从磁性细菌体内提取纳米磁珠,在其表面联上大肠杆菌抗体后用于分离大肠杆菌,但该方法成本较高,因而多采用工业方法制备。1979年,Ugelstad等研发了能生产直径115~100Lm、结构对称的多聚体超顺磁性微*收稿日期:2008-05-16

作者简介:杨万,硕士研究生,从事环境病原微生物检测研究;何

苗(通讯作者),副教授,博士,从事环境污染物的现代生物监测技术研究,hemiao@mail.tsinghua.edu.cn。

基金项目:国家科技支撑计划项目(2006BAC19B06)

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应的表面抗原)发生免疫反应,形成免疫磁珠-靶物质复合物。在外加磁场中,免疫磁珠-靶物质复合物被吸附并滞留在磁场中,而无相应表面抗原的物质由于不能与免疫磁珠表面的特异抗体结合,没有磁性,不能在磁场中停留,从而可分离靶物质。

2 免疫磁珠分离的一般步骤及影响因素

采用免疫磁珠分离样品中病原微生物(细菌、原虫、病毒等)的过程一般包括3个步骤。1)磁珠与特异抗体的联结。

大肠杆菌O157BH7、隐孢子虫等病原微生物已有商品化的包被一抗的免疫磁珠,无需此步骤。2)在样品中加入适量免疫磁珠,孵育一定时间,形成免疫磁珠-靶物质复合物。3)将样品置于磁场,使免疫磁珠-靶物质复合物吸附在试管壁上,吸除上清液;再加入清洗液多次清洗,洗脱免疫磁珠-靶物质复合物表面吸附的杂质。清洗后免疫磁珠-靶物质复合物可用于后续检测(如镜检)。

免疫磁珠分离技术用于病原微生物检测时,影响其分离纯化效果的因素主要包括以下方面。

1)特异抗体。单克隆抗体和多克隆抗体都可用于磁珠的包被,其中单克隆抗体特异性强,能有效减少非特异性吸咐,但不能同时捕获其他不具有相应抗原决定簇的目标病原体,只针对特定抗原决定簇,且价格较高;多克隆抗体在特异性方面不及单克隆抗体,且不同厂家、批次的抗体可能因品质差异而影响检测结果的稳定性,但能同时捕获多种靶物质且较廉价。采用多种单克隆抗体包被磁珠,兼具单克隆抗体的高度特异性及多克隆抗体的广谱性,但成本高。因此,抗体应根据应用或研究目的选择。

2)磁珠尺寸及品质。磁珠尺寸可分为2个级别,小磁珠一般为50~200nm,大磁珠一般为1~10Lm。小磁珠依靠扩散作用、布朗运动在样品中均匀分布,但其回收较难,需强磁力仪器或其他高级系统辅助;大磁珠在样品中易形成沉淀,需适当搅拌才能保持悬浮状态,但其分离简单[5]。病原微生物检测时,一般选用大磁珠。Parham等[6]比较了Dynal、Aure2on、LabM3种品牌的不同尺寸磁珠分离粪便检样中E.coliO157BH7的效果。结果表明,对同一品牌的磁珠,磁性组分含量越高,磁珠越容易分离,粒径越大越有利于磁珠的回收(但对Aureon磁珠,7Lm时不及612Lm),亲水表面的磁珠回收率高于疏水表面;试验中磁珠回收率由高到低依次为612Lm(Aureon)、710Lm(Aureon)、415Lm(Dynal)、115Lm(Aureon)、218Lm(Dynal)、215Lm(LabM)。

3)孵育时间。对靶物质浓度高、杂质少的样品,磁珠能与