分子荧光光谱法又称分子发光光谱法或荧光分光光度法，即通常所谓的荧光分析法。该法是一种利用某一波长的光线照射试样，使试样吸收这一辐射，然后在发射出波长相同或波长较长的光线的化学分析方法。如果这种再发射约在 s内发生，则称为荧光；若能在 s或更长的时间后发生，则称磷光。分子荧光光谱法就是利用这种再发射的荧光的特性和强度来对荧光物质进行定性和定量分析的。 荧光分析法的突出优点是灵敏度高，其测定下限比一般分光光度法低二至四数量级。选择性也比分光光度法好，但其应用不如分光光度广泛，因为只有有限数量的化合物才能产生荧光。

一、基本原理

（一） 荧光光谱的产生

荧光物质分子吸收了特定频率辐射后，由基态跃迁至第一电子激发态（或更高激发态）的任一振动能级，在溶液中这种激发态分子与溶剂分子发生碰撞，以热的形式损失部分能量后，而回到第一电子激发态的最低振动能级（无辐射跃迁）。然后再以辐射形式去活化跃迁到电子基态的任一振动能级，便产生荧光。由于无辐射跃迁的几率大，因此分子荧光波长常常比激发光长。激发光源的波长通常是在紫外区，荧光也可能在紫外区，但更多是在可见区。相对于基态和激发态两个最低振动能级之间的跃迁所产生的荧光称为共振荧光，此时吸收光谱与荧光光谱重叠。

（1）荧光光谱的形状和激发光波长无关，这是因为荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始的而和荧光物质分子原来被激发至哪一个能级无关；（2）荧光光谱的形状和吸收光谱的形状十分相似，且互为镜像。因为吸收光谱反映的是第一电子激发态的能级分布情况；而荧光光谱反映的是基态能级的分布情况，而基态中能级的分布和第一电子激发态中的能级分布是相类似的，所以荧光光谱的形状与吸收光谱十分相似。又因为在相当于由基态中最低振动能能及跃迁到第一电子激发态各振动能级而显示的荧光峰中，基态的振动能级越高，则两个能级的差距越小，即荧光波长越长。所以前后两者不但形状相似而且互为镜像。

（二） 荧光强度与溶液浓度的关系

荧光的产生是由于物质在吸收了激发光部分能量后发射的波长相同或波长较长的光，因此，溶液的荧光强度F与该溶液吸光的强度以及荧光物质的荧光效率成正比：

F=（5-16），又根据朗伯比耳定律：则式中是激发光强度； 是摩尔吸光系数；L是样品池厚度；c是样品浓度。

当激发光强度一定，且浓度很小时，荧光强度与荧光物质浓度成正比。即F=Kc（5-18）

式中（5-18）即荧光法定量分析的基本关系式。此关系只限于极稀溶液，对于较浓的溶液，其吸光度超过0.05时，使荧光物质分子之间以及荧光物质分子同溶剂分子之间的碰撞增加，导致无辐射去活增加耳发生自熄灭。

荧光强度与入射光强度及浓度成正比，所以制药光源强度足够高，入射光强度足够大，并配备一个高灵敏度的检测放大系统，便可提高荧光分析的灵敏度，耳不像分光光度法那样受到浓度的限制。在分光光度法中，吸光度与浓度成线性关系，对很稀的溶液吸收光强度很消（），吸光度A的数值亦趋近于0，难于准