目的建立KRAS基因突变高分辨率熔解曲线分析法(high resolution melting,HRM)检测方法,确立最佳反应体系和反应条件,为将此技术用于临床基因突变的快速检测奠定基础。方法根据引物Tm值设立退火温度梯度,确定适宜的退火温度。利用正交实验,对影响实时荧光定量PCR(qPCR)-HRM反应体系的模板DNA、Mg2+、引物等3种主要因素进行优化。通过对SW480和MDA-MB-231细胞基因组DNA进行HRM

中国实验诊断学 21年 7 筮鲞箜！ 02旦塑 参考文献： []siaH,s i Y,rsk e 1I i oa di v oat ie 1 Ihd Iha uoa aY,t .nvt n i ci t s a r n v vi o e o l x cn a a n tbifl p o u i g p e d mo a e u i o a fl v fo a i g i s o i m r d c n s u o n sa r g n s

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(稿日期：0 1 0— 2 )收 2 1— 3 2

文章编号：0 7 2 7 2 1 )7 17 0 1 0—4 8 ( 0 2 0—1 6— 4

KRAS基因突变高分辨率熔解曲线检测技术参数的优化 刘丽琴，海燕，张王捷 (.方医科大学研究生学院，东广州 5 0 1; . 1南广 1 5 5 2广州军区广州总医院医学实验科，东广州 5 O 1 )广 10 0摘要：目的建立 KR AS基因突变高分辨率熔解曲线分析法 (ihrslt nme ig HR )测方法，立最佳 hg eoui ln, M检 o t确反应体系和反应条件，将此技术用于临床基因突变的快速检测奠定基础。方法根据引物 T值设立退火温度梯为 m度，定适宜的退火温度。利用正交实验，影响实时荧光定量 P R( P R)HRM反应体系的模板 DN Mg、 确对 C q

C一 A、 引物等 3种主要因素进行优化。通过对 S 4 0和 MD— -3 W 8 A MB2 1细胞基因组 D NA进行 HRM分析检测突变，直接测并序验证，察反应体系和反应条件的可行性。结果引物最适退火温度为 6.℃。 KR S基因突变 q C -观 08 A P R HRM最

佳反应体系为：O l P R HR反应体系中，物浓度为 0 5 mo/ Mg 2 C— M q引 .￣ lL,。 2 5mmo/,板 D为 . lL模 NA为 4 g 0n。优化的 q C - P R HRM反应体系和反应条件能检测基因突变，直接测序结果一致。结论和 检测基因突变的临床应用提供借鉴。 关键词：变；分辨率熔解曲线；交实验；化突高正优 中图分类号： 9 R3 2文献标识码： A

采用正交实验优化的 q C— P R

HR反应体系，作简便， M操电泳条带清晰，熔解曲线峰型单一，异性好，果准确可靠，为进一步建立 HR技术特结可 M

TheO p i z to fHi h Re o u in etng An l ssf rK RAS Ge ut to t c in LI Liq n, tmi a in o g s l to M li a y i o neM a insDee to U— i ZH AN G ai H—

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Me i l e a c G a g h u e e l s i l fG a g h u Mi tr o m n G a g h u 5 0 1, h n ) dc s r a R e h, u n z o G n r p t a Ho a o u n z o l a y C m a d, u n z o 1 0 0 C ia i Ab ta tObe t e Toe tbih t eo tma e cins se a dr a t n c n i o so ih rs l t nmet gfr src: j ci v sa ls h pi l a t y tm n e ci o dt n fhg e ou i li o r o o i o n K RA S i t to e e ton, d l he f nu a

ins d t c i an ay t oun ton f he r pi t ci n o t lnia g n i ut to .M e ho da i or t a d de e to n he c i c l e etc m a ins t ds The gr din sofa ne ln e pe a ur e e s ta c r i g t a e t n ai g t m r t e w r e c o d n o Tm a ueo i e n o de o de e m i hea v l fprm ri r rt t r ne t ppr ra e op i t a nne lng tm pe a u e a i e r t r .Theorho na e twa s d t tm ie q t go lt s s u e o op i z PCR— R M e c in s tm n t e t e a t s ic u H r a to ys e i h hr ef c or n l—

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n Mg 22 5mmo/ n rme。 x lL wa sa l h d b t o o a De in Th e ut ewe nHRM n g, C[ . lL a d P i r0 5// se tbi e yOrh g n l sg . ers lsb t e mo s ad

*通讯作者