碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法提取质粒DNA
二、 实验原理
先以低速离心从培养液中收集菌体，带有质粒的细菌经EDTA破坏外膜后，由溶菌酶破坏细胞壁的糖肽层再经去垢剂SDS变性作用，使细胞膜蛋白质变性崩解而使胞内DNA全部释放出来。利用染色体DNA与质粒DNA在强碱条件下变性与复性的差异分离质粒DNA。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液将pH值调节至中性时，变性的质粒DNA会恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。用等体积饱和酚或氯仿使沉淀变性的蛋白质和染色体分离，再用乙醇沉淀上清液中的质粒DNA。
② 氨苄青霉素(Ampicillin， Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液， -20℃保存备用。
③ 溶液I(pH8.0)：
终浓度 需称/量取
葡萄糖 50mmol/L； C6H12O6.H2O 1.982 g EDTA 10mmol/L； 0.5mol/L 4 mL Tris-HCl（PH8.0） 25mmol/L； 1mol/L 5 mL 加DDW定容至200ml，高压灭菌后于4℃保存备用。
④ 溶液II(pH12.5)：
NaOH 0.4mol/L； 称取1.6g，加DDW定容至100ml
SDS 2%（W/V）； 称取2.0g，加DDW定容至100ml
室温存放，临用时将二者对半混匀即可。
⑤ 溶液Ⅲ(pH4.8)：100ml
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
DDW 28.5ml
高压灭菌后于4℃保存备用。
⑥ TE(pH8.0)：
Tris-HCl（PH8.0） 10mmol/L
EDTA（PH8.0） 1mmol/L
⑦ TE+R:1mlTE+5ulRNase
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