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第23卷第1期第　三　军　医　大　学　学　报Vol.23,No.1

2001年1月ACTA　ACADEMIAE　MEDICINAE　MILITARIS　TERTIAEJan.2001

技术方法

单细胞凝胶电泳技术操作

Experienceinmethodofsinglecellgelelectrophoresisoperation

文章编号:100025404(2001)0120116202

梁培禾,靳风烁,贾思远,周紫垣　　(第三军医大学附属大坪医院野战外科研究所泌尿外科,重庆400042)

　　提要:目的　探讨单细胞凝胶电泳技术影响因素,总结其实验方法。方法　以Singh等提出的碱性SCGE为基础,并加以改进。

结果　获得了典型的彗星图像,实验效果良好。结论　SCGE简便易行,应用广泛,但应注意控制影响因素,以保证其结果的可靠。

　　单细胞凝胶电泳(Singlecellgelelectrophoresis,SCGE)又称彗星试验(Cometassay),可在单细胞水平灵敏、快速地检测DNA损伤。我们在研究急性肾衰肾小管上皮细胞DNA损伤过程中积累了一些经验,与大家交流。1　资料与方法

　　肾小管细胞分离(略),SCGE步骤如下:①45℃,100μl1.0%正常熔点琼脂糖(NMA)PBS凝胶浇注于磨砂载玻片上,加盖玻片4℃,10min固化;②37℃,细胞PBS悬液与低熔点琼脂糖(LMA)PBS凝胶混匀,移去盖玻片,75μl滴于第1层NMA上,

μ加盖玻片,同前固化(细胞:130Πl,LMA:0.6%);③同前铺第3

层无细胞0.6%LMA,并固化;④移去盖玻片,浸入细胞裂解液4℃,2h;⑤水平电泳槽,高pH电泳缓冲液浸泡20min;⑥低温(<15℃),300mA,25V,电泳20min;⑦pH7.5,0.4molΠLTris浸洗,5min×3次;⑧20mgΠL溴化乙啶(EB)染色15min,荧光显微镜观测、摄影。　　细胞裂解液及电泳缓冲液配制,见文献[1]。

　　目前SCGE方法尚未完全标准化,应用最广的是

[1]

Singh等提出的碱性SCGE,实验中,应注意以下几点:　　准备:所有器械泡酸,蒸馏水清洗;实验环境无灰尘,实验前洗手,避免杂质混入,见图2。准备微量恒温器、冰盒等,除铺胶外,其余步骤在低温下操作,防止DNA损伤的修复

。

2　结果与讨论

　　获得了典型、清晰的彗星图像,见图1,慧尾长度适中,细胞分布均匀,密度合理,杂质干扰少,准确反映了DNA损伤程度

。

图2　杂质　　注意右侧图像,较为“机械”,失去了细胞特征

图1　典型的彗星图像

　　基金项目:全军“九五”医药卫生重点课题资助项目(96L053)

　　作者简介:梁培禾(1972-),男,山西省平遥县人,医师,主要从事急性肾功能

衰竭方面的研究。电话:(023)68757344

　　收稿日期:2000201212;修回日期:2000204210

　　制备凝胶三明治:NMA适宜浓度0.5%～1%,过

高或过低将造成凝固速度过快而不易铺平或粘着力低而脱落,铺胶前载玻片预热,有利于铺植平整。

[1]

　　LMA凝胶浓度直接关系到DNA迁移长度,0.6%较适宜。单片凝胶含细胞1×10为适合密度。第3层LMA可不铺。微量加样器吸头前端残留凝胶勿吹出,以防形成气泡。移去盖玻片时注意勿损伤胶膜。　　碱化处理及电泳条件:SCGE分中性和碱性法两种,中性用于检测DNA双链断裂(DSBs),只限于研究

[2]

射线和拟辐射化合物对DNA的损伤作用。而碱化处理可检测SSBs、DSBs和碱性不稳定损伤。据报道许多处理因素造成的SSBs要比DSBs多5～2000倍,因此碱性SCGE大大提高了检测灵敏度。碱处理时间延

[2,3]

长可使DNA损伤表达增加,提高SCGE的灵敏性。我们采用20min,效果满意。　　电泳时电压、电流及时间的长短会直接影响DNA迁移长度,造成假阳性或假阴性。文献[1～4]报道为18～50V,200～300mA,20～40min。我们采用25V,300mA,20