酵母单杂交的原理与应用实例

酵母单杂交的原理与应用实例

酵母单杂交的原理与应用实例

酵母单杂交的原理与应用实例

陈 峰 李 洁 张贵友 刘 强

(清华大学生物科学与技术系植物分子生物学实验室 北京 100084)

摘要 许多诱导型基因的表达,都受特定的转录因子和顺式元件调控。要阐明各种信号传递途径

与基因表达调控的机理,克隆和鉴定转录因子是关键。近年来酵母单杂交方法被广泛应用于克隆和鉴定各种动植物的转录因子,本文以拟南芥DREB转录因子的克隆为例,介绍酵母单杂交方法的原理和具体应用。关键词 酵母单杂交 基因表达 顺式作用元件 转录因子  真核生物中各种转录因子在转录水平的调控是基因表达调控的主要方式。典型的转录因子都有DNA结合区与转录激活区(或抑制区),在特定的时间、部位或特定条件(如胁迫条件)下,互作用,,以及细胞表达调控等机理,鉴定各种调控基因表达的顺式作用元件和转录因子至关重要。

酵母单杂交方法(YeastOne2hybridmethod)是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转

[1]

录因子的基因(cDNA)。该方法也是在细胞内(in

vivo)分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效

的结果

酵母单杂交的原理与应用实例

图1 酵母单杂交原理示意图

转录因子与顺式元件结合,激活最基本启动子Pmin,使报道基因表达。构建3个顺式元件,可增强转录因子的识别和结合效率。

Yamaguchi2Shinozaki等从干旱处理的拟南芥中

方法。如图1所示,将已知的特定顺式作用元件构

建到最基本启动子(minimalpromoter,Pmin)上游,Pmin启动子下游连接报道基因。进行cDNA融合表

克隆了9个受干旱胁迫诱导基因,定名为RD(re2sponsivetodehydration)基因群。其中最引人注目的一个是rd29A基因,它不仅受干旱的诱导,也受高盐及低温的诱导。通过启动子分析,鉴定出与干旱高盐及低温胁迫下rd29A基因表达调控有关的顺式作用元件,称为DRE顺式作用元件(dehydration2respon2

[5]

siveelement),序列为TACCGACAT。Liu等利用DRE顺式作用元件和酵母单杂交方法,克隆了与DRE元件特异性结合并在上述胁迫条件下调控报

达文库筛选时,编码目的转录因子的cDNA融合表

达载体被转化进入酵母细胞后,其编码产物(转录因子)与顺式作用元件结合,就可以激活Pmin启动子,并促使报道基因表达。根据报道基因的表达,筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。Wang和Reed最初利用酵母单杂交方法,从嗅觉上皮神经元中克隆到编码OLF21转录因子的cDNA

[2]

。随着酵母单

道基因表达的DREB转录因子。本文以DREB转录因子基因(cDNA)的克隆为例,介绍如何应用酵母单杂交方法来获得编码特定转录因子的cDNA,并验证它与特定的顺式作用元件的结合。

1 cDNAAD融合表达文库(cDNAADfusionli2

brary)的构建

[6]

杂交系统的不断发展和完善,该方法近年来已被广泛用于克隆和鉴定各种动植物的转录因子。例如,限制哺乳动物神经元钠通道基因表达的一种沉默子蛋白REST

[3]

,与胡萝卜Dc3基因启动子ABA诱导

[4]

和胚特异性表达相关的顺式元件相互作用的一族新的bZIP转录因子

,都是应用酵母单杂交方法获得

  应用酵母单杂交方法筛选编码特定转录因子的

57

Word文档免费下载Word文档免费下载:酵母单杂交的原理与应用实例 (共6页,当前第1页)

酵母单杂交的原理与应用实例相关文档

最新文档

返回顶部